Determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada

FUNDAMENTO
La recalcificación del plasma pobre en plaquetas (PPP) se realiza mediante la adición de una solución de cloruro cálcico. El sustituto del f3p consiste en una suspensión de fosfolipidos , obtenida a partir de cerebros de conejos, que recibe el nombre de cefalina.

En esta prueba, también se añade con la cefalina unas sustancia activadora de los factores de contacto.Como activadores de los factores de contacto se pueden utilizar: el coalin , el polvo de vidrio , el silice, el celite y el ácido alérgico

MATERIAL

• Gradilla
• Coagulómetro, pocillos y trozos de acero para el coagulómetro
• Micropipeta de 100ul y puntas de micropipeta
• Baño de agua
• 4 tubos de ensayo de plástico
• REACTIVOS: Cloruro cálcico, cefalina activada, plasma control o pool de plasmas normales

MUESTRA
Plasma pobre en plaquetas (PPP)

PROCEDIMIENTO

1.. Llemanos en un tubo de centrifuga de plástico la mitad del tubo de sangre y lo metemos en la centrifuga a 3000 rpr durante 10 minutos

2.. Retiramos el plasma con una pipeta pasteur y lo depositamos en un tubo de plástico

3.. Añadimos en la cubeta 100 ul de plasma y 100 ul de R1

4.. Añadimos en la cubeta 100 ul de R2

5.. Lo dejamos calentar durante dos minutos, cuando queden veinte segundos retiramos e tubo numero 1 y lo depositamos debajo del tapón rojo

6.. Cogemos 100 ul de reactivo R2 y lo añadimos en el tubo numero 1 y leemos el resultado.

LECTURA DE RESULTADOS
En la práctica realizada en clase se han obtenido los siguientes resultados:

   - TTPA de la muestra:  5.3 segundos

   - TTPA del control:  28.1 segundos

Diferencia entre el TTPA de la muestra y el TTPA del control:5.3-28.1= - 22.8

Cociente entre el TTPA de la muestra y el TTPA del control:5.3/28.1=  0.188

Con estos resultados podemos decir que nuestra muestra tiene un TTPA acortado

Test de Howell

FUNDAMENTO
Se vierte el plasma rico en plaquetas (PRP) en un tubo de vidrio, se le añade una solución de cloruro cálcico y se incuba la mezcla a 37ºC.
El resultado del test de Howell es el tiempo transcurrido desde la adicción del Cloruro cálcico al PRP hasta la coagulación de este.

MATERIAL

• 2 tubos de hemólisis 
• 4 micropipetas de 100 ul (0.1ml)
• Baño de agua
• Cronómetro
• REACTIVOS: suero salino, solución de cloruro cálcico, plasma control o pool de plasmas normales

MUESTRA
Plasma rico en plaquetas (PRP)

PROCEDIMIENTO
1.. Atemperamos los reactivos y la muestra a 37ºC.
2.. Rotulamos un tubo de hemólisis con la letra M y otro con la C.
3.. Metemos los tubos en el baño.
4.. Depositamos 0.1ml de muestra en el tubo M y 0.1 de control en el C. Añadimos 0.1ml de solución salina a cada uno
5.. Agregamos 0.1 ml de cloruro cálcico a cada tubo de forma simultanea y ponemos el cronómetro en marcha.
6.. Cogemos los tubos por el extremo superior y los balanceamos suavemente sin sacarlos del agua. Lo haremos a un ritmo de una inclinación por segundo
7.. Parar el cronómetro cuando se aprecie un enturbiamiento y solidificación en los tubos

LECTURA DE RESULTADOS
En la práctica realizada en clase el tubo con la muestra ha tardado en coagular 130 segundos y el control ha tardado 135 segundos.

Los valores normales están establecidos entre 130 y 90 segundos. Por lo que nuestros resultados están dentro de la normalidad

Determinación funcional fribrinógeno

FUNDAMENTO

Según el método de Von Clauss , se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibrinogeno presente en un PPP diluido y , por tanto, en formar un coagulo

El tiempo que tarda en hacerse el coagulo de fibrina depende, de la cantidad inicial de fibrinogeno y es inversamente proporcional a la concentración de este en el plasma estudiado

MATERIAL

• 8 Tubos de ensayo de plástico
• micropipeta de 1000ul 2000ul 100ul y 200ul
• Coagulómetro. cubetas y trocitos de acero
• REACTIVOS: fibrinogene kit, plasma calibrador y agua destilada

MUESTRA
Plasma pobre en plaquetas (PPP)

PROCEDIMIENTO
1.. Homogeneizamos los reactivos
2.. Hacemos la siguiente bateria de diluciones:

Plasma calibrador	100	100	100	100	100	100	100
Muestra	0	0	0	0	0	0	100
Tampón	400	900	1400	1900	2400	2900	900
Fibrinogenemia	1/5	1/10	1/15	1/20	1/25	1/30	1/10

3.. Atemperamos la bovina a temperatura ambiente

4.. Preparamos las cubetas del coagulómetro introduciendo una barilla de acero en su interior y vertemos 200ul de cada dilución en su cubeta correspondiente.

5.. Incubamos a 37ºC dos minutos. Lo hacemos en la placa calefactora del coagulómetro

6.. Colocamos por orden todas las cubetas en el coagulómetro y vertemos 100ul de trombina bovina. En este momento se pondrá en marcha en magnetoagitador y comenzará la lectura.

Fragilidad osmótica de los hematíes

FUNDAMENTO
Valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente en condiciones constantes de pH y de temperatura

MATERIAL

• Espectofotómetro y cubetas 
• Gradilla
• Pipetas pasteur
• Tubos de ensayo
• Reloj
• REACTIVOS: suero fisiológico y agua destilada

MUESTRA
Sangre venosa anticoagulada

PROCEDIMIENTO
1.. Rotulamos 18 tubos y hacemos la siguiente batería de disoluciones:

nº tubos	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18
agua destilada	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
suero fisiológico	18	17	16	15	14	13	12	11	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1
concentración obtenida	9	8.5	8	7.5	7	6.5	6	5.5	5	4.5	4	3.5	3	2.5	2	1.5	1	0.5

2.. Añadimos en cada tubo una gota de sangre. Agitamos para homogeneizar. Dejamos reposar 30 minutos
3.. Centrifugamos 2000 rpm 5 minutos
4.. Retiramos el sobrenadante y lo vertemos en las cubetas del espectofotómetro
5.. Medimos la absorbancia con el espectofotómetro y anotamos los resultados

LECTURA DE RESULTADOS
En clase hemos realizado la práctica con 8 tubos. Los resultados han sido:
  Tubo1: 23.39%
  Tubo2: 43.77%
  Tubo3: 65.47%
  Tubo4: 96.50%
  Tubo5: 100%
  Tubo6: 50.18%
  Tubo7: 90.94%
  Tubo8: 96.32%

% DE HEMOLISIS = A/AM x 100
A: absorbancia de cada tubo
A: absorbancia del tubo nº 18

Mezcla con plasma normal

FUNDAMENTO

se dertemina cuando el TP normal y un TTPA alargado, en esta circunstancia se supone , que el paciente sufre un deficit de algun factor de la via intrinseca y en correcto , de los factores VIII , IX o XII

MATERIAL

• Gradilla
• 2cubetas coagulómetro, coagulómetro y varillas de acero
• Micropipeta de 100ul
• Baño de agua 
• Tubos de ensayo
• REACTIVOS: Cloruro cálcico, cefalina activada, pool de plasmas normales o Plasma control normal

MUESTRA
Plasma pobre en plaquetas (PPP)

PROCEDIMIENTO

1.. Cogemos un tubo de ensayo de plástico y echamos 55 ul de PPP y 55 ul de serican anormal

2.. Lo introducimos en el baño María durante 15 minutos a 37ºC

3.. Cuando lo sacamos del baño Maria , ponemos una cubeta en el coagulometro y añadimos 100 ul del contenido de los tubos

4.. Añadimos la varilla de acero y lo dejamos 2 minutos en el coagulómetro

5.. Ponemos 100 ul de cefalina activada

6.. Cuando queden 20 segundos se saca la cubeta y la introducimos debajo del tapón rojo, lo tapamos e introducimos 100 ul de cloruro cálcico

LECTURA DE LOS RESULTADOS
No hemos podido ver los resultados finales por falta de tiempo para la práctica

Preparación de una curva de actividad de la protrombina

FUNDAMENTO 

Para construir una curva de actividad de la protrombina se prepara una batería de disoluciones, a partir de un plasma control normal y se mide el TP del plasma control normal no diluido y de cada una de las disoluciones preparadas

MATERIAL

• 8 Tubos de ensayo
• Pipeta de 1ml
• Prepipeta de 100 y 200ul
• 5 Cubetas de coagulómetro y trocitos de acero
• Coagulómetro
• Baño de agua
• Regla, bolígrafo y hoja de papel milimetrado
• Gradilla
• REACTIVOS: Solución salina, tromboplastina cálcica, pool de plasmas normales o plasma control normal

PROCEDIMIENTO

1.. Centrifugamos la sangre de un compañero de clase

2.. Sacamos el plasma obtenido y lo mezclamos con otro plasma de años anteriores

3.. Rotulamos los 5 tubos de ensayo (100; 50; 33; 25; 10)

4.. Realizamos la siguiente bateria de pruebas:

Pool plasmas ul	200	200	200	200	200
s. salina (ul)	0	200	400	600	1800
Dilución	1/1	½	1/3	¼	1/10
% Actividad	100	50	330	25	10

5.. Rotulamos las cubetas y las introducimos en el coagulometro

6.. Echamos 100 ul de cada tubo en las cubetas

7.. Añadimos en una cubeta reactivo

8.. Ponemos el tubo 100 debajo del tapón rojo y añadimos 200 ul y en los demás tubos hacemos el mismo proceso

9.. Leemos los resultados con el coagulómetro

LECTURA DE RESULTADOS








Plasma control no diluido = 12.3
Plasma control diluido = 19
Plasma control 1/3 = 25.3
Plasma control 1/4 = 32.4
Plasma control 1/10 = 61.3