PCR

DIA 1
MATERIAL

• Gradilla
• Micropipeta
• Vaso de precipitado
• Centrifuga
• Papel para film
• Pipeta de vidrio de 5 ml
• Prepipeta 
• Tubos de ensayo
• Ependoff
• Rotulador de vidrio
• Palillo
• Bata
• Guantes
• Papel de fieltro
• REACTIVOS: suero salino, purificador de ácidos nucleicos

MUESTRAMucosa bucal

PROCESAMIENTO1.Añadimos en un vaso de precipitado suero salino
2.Colocamos un tubo de ensayo en la gradilla , y depositamos con una pipeta de vidrio de 5 ml , 3 ml de suero en el tubo
3.Nos enjuagamos la boca con agua y rascamos ambos lados internos de la misma con un palillo
4.Introducimos el palillo en el tubo de ensayo y lo mezclamos unos 2 minutos aproximados
5.Extraemos de ahí 1.4 ul y lo introducimos en un eppendof
6.Lo centrifugamos a 8000 rpm durante 5 minutos
7.Retiramos el sobrenadante
8.Añadimos en el eppendor 70 ul de matriz instangene , e incubamos en una maquina de baño seco durante 10 minutos a 100 grados centigrados
9.Dejamos enfriar y centrifugamos a 13.000 rpm durante 30 minutos
10.Por ultimo extraemos 10 ul del tubo de eppendof y lo depositamos en otro tubo nuevo
11.Lo congelamos



DIA 2

MATERIAL:

• Vaso de precipitado
• Bata
• Guantes
• Micropipeta de 2 ul , 18.5 ul y 2.5 ul
• Puntas 
• de micropipeta
• Centrifuga
• Termociclador
• Tubo de ready to go
• Gradilla de corcho
• Rotulador de vidrio
• REACTIVOS: oligo 1, oligo 2. agua destilada

MUESTRA:2.5 ul de eppendor preparada en la primera parte

PROCEDIMIENTO1.Preparamos el agua destilada en un vaso de precipitado
2.Cogemos una gradilla de corcho y colocamos el eppendof de nuestro ADN y el tubo ready to go
3.Extraemos 2.5 ul de nuestro ADN y lo depositamos en un ready to go y añadimos al mismo 2 ul de aligo 1 y 2 ul de oligo 2 y finalmente 18.5 ul de agua destilada
4.Mezclamos suavemente
5.Centrifugamos un golpe
6.Colocamos el tubo ready to go en el termociclador , cerramos la tapa y ya comienza los 30 ciclos
7.Lo retiramos y se guarda en frigorífico

DIA 3

MATERIAL:

• Balanza
• Pipeta de 10 ml
• Vaso de precipitado
• Rotulador de vidrio
• Microondas
• Matraz
• Probeta de 100 ml
• Micropipeta de 1.5 ul
• Puntas desechables
• Bata
• Guantes
• Vidrio de reloj
• REACTIVOS: agua destilada, agarosa, red safe nucleic.

PROCEDIMIENTO
1.Pesamos 1.5 g de agarosa en la balanza y la depositamos en una probeta de 100 ml
2.Añadimos 10 ml de tampón en la probeta de 100 ml y depositamos la disolución de agarosa
3.A continuación ,enrasamos hasta 100 ml de agua destilada
4.Lo depositamos la mezcla en un matraz Erlenmeyer
5.Calentamos en microondas unos segundos
6.Lo sacamos y lo movemos un poco y lo volvemos a calentar , hasta ver que esta totalmente diluida la mezcla
7.Dejamos enfriar unos minutos
8.Añadimos 1.5 ul de red safe nucleic acid staining solution y ya tenemos lista la agarosa para realizar la electoforesis que seria el ultimo proceso

ELECTROFORESIS

MATERIAL:

• Balanza
• Vidrio de reloj
• Prepipeta
• Pipeta de vidrio de 2 ml
• Probeta de 10 ml
• Cubeta especial
• Cinta adhesiva
• Fuente de alimentación
• Eppendof
• Micropipeta de 10 ul y 5 ul
• Puntas desechables
• Bata
• Guantes
• Papel de fieltro
• REACTIVOS: ladder, agarosa, tampon de carga, tampon TAE

MUESTRA:
Primer eppendof:9 ul de ADN replicado + i ul de tampón de carga
Segundo eppendof: 4.5 ul de ladder + 0.5 ul de tampón de carga

PROCEDIMIENTO
1.Colocamos cinta adhesiva en la cubeta donde se va a depositar agarosa
2.Depositamos agarosa lentamente para que no se produzcan burbujas y lo dejamos actuar unos 30 minutos aproximadamente
3.Retiramos las dos peines y lo colocamos en la bandeja de fuente de alimentación .
4.Los palillos deben estar en cátodo , y la muestra debe moverse hacia el ánodo
5.Añadimos el tampón TAE
6.Añadimos control en las esquinas
7.A continuación ,depositamos en pocillos la muestra , 9 ul de DNA + 1 ul de tampón de carga.
8.Una vez llenados los palillos conectamos los cables en la fuente de alimentación y aplicamos una corriente de 120 voltios durante 30 minutos
9.Visualizamos los fragmentos de ADN en luz ultravioleta