Tinción de Wright

INTRODUCCIÓN.

Una muestra la podemos teñir con un colorante ácido, como el azul de metileno, combinándolo con un colorante básico, como la eosina. 

De este modo conseguiremos una tinción diferencial capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares según sean basófilas o acidófilas.

Según la proporción de azul de metileno o eosina que compongan el colorante tendremos distintos métodos de tinción. Los más conocidos son: Giemsa, Wright, Leishman y el panóptico rápido de Pappenheim.

PARA REALIZAR LA PRÁCTICA.

FUNDAMENTO

El colorante utilizado es el colorante Wright: una solución de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10 al 25%) junto con otros derivados del alcohol metílico.

Dada la presencia de metanol en la composición del colorante, no es necesario un paso previo de fijación antes de la coloración.

Solo fijaremos la extensión si las vamos a guardar sin teñir de un dia para otro, para evitar su deterioro.

MATERIAL

• Microscopio
• Cristalizador
• Puente de tinción
• Pipetas Pasteur con chupete
• Frasco lavador con agua destilada
• Guantes 
• Para sangre venosa: capilar tubo de ensayo, gradilla y bolsa de hemodonación.
• Para sangre capilar: capilar, lanceta, gasa y alcohol para desinfectar.
• Reactivos: solución de eosina-azul de metileno según Wright, solución tampón pH 7,2, aceite de inmersión.

MUESTRA

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada.

PROCEDIMIENTO

1.. Realizamos una extensión de sangre (venosa o capilar) y dejamos secar al aire.

2.. Con el porta de la extensión colocado horizontalmente sobre el puente de tinción verter 1ml de colorante Wright y dejamos actuar un minuto.

3.. Transcurrido ese minutos escurrimos el colorante Wright y lavamos con solución tampón pH 7,2. Escurrimos bien y dejamos secar en posición vertical.

4.. En un tubo de ensayo diluimos 0'5 ml de colorante según Wright con 0'5 ml de solución tampón pH 7'2. Mezclamos bien en el tubo de ensayo y cubrimos la extensión con la solución. Dejamos teñir durante 3-5 minutos.

5.. Pasados los minutos, lavamos con agua del grifo y más adelante con solución tampón pH 7'2.

6.. Dejamos escurrir y secar en posición vertical.

7.. Colocamos el porta con la muestra en la platina, y con el objetivo de 100x observamos la muestra colocando una gota de aceite de inmersión.

LECTURA DE RESULTADOS.

Las células se observan coloreadas de la misma manera que con la tinción Giemsa.

Tinción de Giemsa

INTRODUCCIÓN

Una muestra la podemos teñir con un colorante ácido, como el azul de metileno, combinándolo con un colorante básico, como la eosina. 

De este modo conseguiremos una tinción diferencial capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares según sean basófilas o acidófilas.

Según la proporción de azul de metileno o eosina que compongan el colorante tendremos distintos métodos de tinción. Los más conocidos son: Giemsa, Wright, Leishman y el panóptico rápido de Pappenheim.

PARA REALIZAR LA PRÁCTICA

FUNDAMENTO

Utilizaremos el método de tinción propuesto por Giemsa.

MATERIAL

• Microscopio óptico
• Portas
• Cristalizador
• Puentes de tinción
• Pipetas Pasteur con chupete
• Frascos lavadores 
• Tubos de ensayo 
• Papel de filtro para cubrir la mesa de trabajo.
• Reactivos: colorante según Giemsa, Solución tampón pH 7,2, metanol y aceite de inmersión.

MUESTRA

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada.

PROCEDIMIENTO

1.. Colocamos el puente de tinción sobre el cristalizador
2.. Realizamos una extensión de sangre
3.. Una vez realizada la extensión la ponemos sobre el puente de tinción.
4.. Cubrimos con metanol la extensión y esperamos unos 3 minutos que se fije la muestra.
5.. Pasados esos 3 minutos retiramos el metanol escurriéndolo.
6.. En un tubo de ensayo diluimos 0.2 ml de azur-eosina-azul de metileno (Giemsa) con 2ml de solución tampón pH 7,2. Debemos realizar la dilución en el momento de hacer la práctica, ya que no nos valdrá para otro día,
7.. Mezclamos la dilucion realizada en el tubo de ensayo con movimientos circulares suaves. Con una pipeta Pasteur cubrimos la extensión con el colorante realizado anteriormente (Giemsa). Dejamos actuar el colorante durante 25 minutos.
8.. Escurrimos y lavamos con agua del grifo, y posteriormente con tampón pH 7.2 hasta eliminar los restos del colorante.
9.. Dejamos escurrir y secamos en posición vertical.
10.Para ver la muestra al  microscopio utilizaremos el objetivo de 100x, por lo que echaremos una gota de aceite de inmersión a la muestra, una vez seca, y la examinaremos al microscopio. 

LECTURA DE RESULTADOS

Los glóbulos rojos se tiñen de color rosa asalmonado y las plaquetas de color violeta.

Los neutrófilos presentan el núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de color violeta rojizo.

Preparación de gota gruesa

INTRODUCCIÓN

El paludismo es una enfermedad producida por parásitos del género Plasmodium (causante de la malaria).

De estos parásitos palúdicos existen cuatro especies. Éstos, en algunas etapas de su ciclo vital,se encuentran en la sangre periférica en la que pueden observarse infectando a los hematíes, o también, en el exterior de las células.

PARA REALIZAR LA PRÁCTICA

FUNDAMENTO

Para el estudio microscópico de muestras sanguíneas que puedan contener parásitos palúdicos se hace una preparación en forma de extensión fina y otra de gota gruesa en el mismo porta.

En la extensión fina se debe prestar atención a los hematíes infectados y a los parásitos que hay dentro de ellos para establecer o confirmar un diagnóstico de paludismo.

En la gota gruesa, los parásitos suelen ser más abundantes y compactos que en la extensión fina. Los hematíes están lisados, por lo que el diagnóstico de paludismo se basa en el aspecto de los parásitos que puedan encontrarse.

MATERIALES

• Capilar heparinizado, si la muestra es sangre capilar, o no heparinizado, si la muestra es sangre venosa anticoagulada.
• Pipeta Pasteur (para la muestra de sangre venosa)
• 2 portaobjetos
• Vaso de precipitado
• Reactivos: Metanol, Agua destilada y una solución de Giemsa al 3%

MUESTRA

Sangre capilar o venosa anticoagulada.

PROCEDIMIENTO.

1.. Hacemos la punción cutánea o extraemos la muestra de sangre de la bolsa de hemodonación.

2.. Una vez tengamos la muestra de sangre que deseamos, situamos una pequeña gota de sangre en el centro del portaobjetos y realizamos la extensión sanguínea. 

3.. Colocamos tres gotas a la derecha de la extensión sanguínea. Estas tres gotas deben formar un triángulo cuya base va dirigida hacia la extensión.

4.. Con la esquina del porta extensor,  unimos las tres gotas de sangre con movimientos rapidos y circulares, hasta que nos quede una capa gruesa y uniforme.
Al mover de esta forma la sangre conseguimos la desfibrinación de la misma.
5.. Dejamos secar la muestra en posición horizontal
6.. Fijamos la extensión fina sumergiendo la zona del porta donde tenemos la extensión en un vaso de precipitado con metanol.
7.. Dejamos secar 24 horas la muestra en posición horizontal, tiempo necesario para que la gota gruesa se seque.
8.. En una cubeta de coloración vertemos la solución Giemsa al 3%
9.. Sumergimos la muestra en la solución durante 30 - 45 minutos. Debe cubrirse toda la muestra (extensión y gota gruesa)
10.. En un vaso de precipitado con agua destilada, transcurridos los 30-45 minutos de tinción, sumergimos el porta hasta aclarar la muestra y retirar el exceso de la tinción.
11.. Dejamos secar la muestra en posición vertical.
12.. Una vez seca la muestra, la colocamos y observamos en el microscopio.


LECTURA DE LOS RESULTADOS
En la práctica realizada en clase, no hemos podido ver parásitos palúdicos, ya que la sangre que estudiamos es sangre de gente sana.
Un error cometido es el exceso de tinción en la muestra.

Síntomas de la malaria. 

Muestra sanguínea de una persona
enferma de malaria.

Realización de una extensión sanguínea.

MUESTRA
Las extensiones podemos realizarlas con sangre venosa anticoagulada o sangre capilar no coagulada

MATERIAL

• Lancetas (para la sangre capilar)
• Tubo de ensayo (para la sangre venosa)
• Portas bien limpios
• Porta para realizar la extensión (preferiblemente esmerilado)
• Capilar no heparinizado para la sangre venosa y heparinizado para la sangre capilar.
• Algodón y alcohol para desinfectar la zona de la punción.

PROCEDIMIENTO.
1.. Con los dedos indice y pulgar sujetamos el porta apoyado en la mesa con el que vamos a depositar la gota de sangre. (porta soporte)
2.. Llenamos el capilar de sangre (venosa o capilar), y depositamos una gota de sangre a unos 2cm del extremo opuesto que sujetamos con la mano.

3.. Colocamos el porta extensor delante de la gota formando unos 45º y lo desplazamos hacia atrás hasta que alcance la gota de sangre y por la tensión superficial de la sangre el borde quede cubierto de sangre,
4.. Una vez cubierto de sangre todo el borde del porta extensor, deslizamos hacia delante , con un movimiento firme y uniforme, y a una velocidad media.
5.. El deslizamiento debe acabar, aproximadamente, a un 1cm del extremo final del porta de soporte

LECTURA DE LOS RESULTADOS.
A la hora de leer los resultados, se han de tener en cuenta las características propias de una buena extensión y los defectos que puede tener una extensión incorrecta.

Formas incorrectas de realizar una extensión

Preparación de sangre en fresco

INTRODUCCIÓN

Al teñir las muestras corremos algunos riesgos como que las proteínas se coagulen, o la solubilización de los hidratos de carbono y las grasas.
Con esta práctica, al no usar ningún tipo de tinción, podremos ver la estructura natural de las células, o los cambios estructurales en procesos patológicos.

PARA REALIZAR LA PRÁCTICA.

Esta práctica la podemos hacer con sangre venosa o con sangre capilar.

MATERIAL.

• Microscopio
• Portas y cubres
• Papel de filtro
• Con sangre capilar: lancetas, gasas, alcohol 70º y capilares
• Con sangre venosa: pipetas pasteur, tubo de ensayo, gradilla y bolsa de hemodonación.

MUESTRA.

Sangre capilar, o venosa.

PROCEDIMIENTO

Con sangre capilar: 

Haremos la punción en la yema de los dedos 

1.. Desinfectamos la zona con una gasa humedecida en alcohol, y dejamos secar. 

2.. Hacemos la punción con la lanceta, y desechamos la primera gota, ya que está contaminada con el alcohol. Para ello retiramos la gota con una gasa. 

3.. Hacemos una leve presión en el dedo y recogemos la sangre con un capilar.

4.. Dejamos caer unas dos gotas de sangre del capilar en un porta, y cubrimos con el cubre.

5.. Colocamos el porta en la platina del microscopio, y con el objetivo de 40x observamos la muestra.

Con sangre venosa:

Cogemos una porción de sangre venosa de una bolsa de hemodonación

1.. Llenamos una pequeña parte del tubo de ensayo con sangre de la bolsa de hemodonación

2.. Colocamos el tubo de ensayo en una gradilla, y con la pipeta Pasteur cogemos una pequeña cantidad de sangre 

3.. Vertimos unas dos gotas en el portaobjetos y cubrimos con el cubreobjetos.

4.. Colocamos el porta en la platina y observamos la muestra con el objetivo de 40x

LECTURA DE LOS RESULTADOS.

  

Con esta práctica podemos ver los glóbulos rojos (hematíes) plaquetas, y glóbulos blancos (leucocitos).

Estudio microscópico de la cristalización de la saliva.

INTRODUCCIÓN

En el periodo preovulatorio de una mujer, debido al crecimiento de estrogeno en su organismo, empiezan a formarse unos cristales en forma de helecho en su saliva, que aumentaran en cantidad y tamaño a medida que nos acerquemos al periodo ovulatorio.
Los cristales que podemos ver en la saliva van a ir descendiendo pasados unos tres días de la ovulación.
En el periodo post-ovulatorio los cristales van desapareciendo, ya que hay un aumento de progesterona en el plasma.
Son casi inexistentes en la ultima semana del ciclo menstrual.

PARA REALIZAR LA PRáCTICA:

MATERIAL.

• Microscopio
• 2 portaobjetos
• Un pañuelo de papel
• Palillo de dientes (mondadientes)
• Mechero de laboratorio
• Pinzas

MUESTRA.
Saliva. (Debemos enjuagarnos la boca antes)


PROCEDIMIENTO.
1.. Nos introducimos el palillo para los dientes en la boca hasta sacar saliva suficiente para la muestra (con una o dos gotas bastará).
2.. Depositamos las gotas sobre el portaobjetos, y con el mechero y ayuda de las pinzas, secamos la muestra. Con este proceso conseguimos que la muestra se adhiera al portaobjetos
3.. Colocamos el portaobjetos en la platina del microscopio y enfocamos con los objetivos, menos con el de inmersion. Es preferible la observación de la muestra con el objetivo de 10x.

Para ver mejor la muestra debe ser atravesada por poca luz, para ello cerraremos parcialmente el diafragma del microscopio.


LECTURA DE LOS RESULTADOS.
Como ya hemos visto, según en el periodo del ciclo menstrual que se encuentre la mujer a la que se le extrae la muestra, la cristalización puede ser clara y abundante, mediana, y nula.
Los cristales tienen forma de helecho.

Observación de las células de la cebolla

MATERIAL

• Cebolla
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Vaso de precipitado
• Vidrio de reloj
• Pinza
• Microscopio
• Frasco lavador con agua destilada
• Reactivo: Azul de Metileno

MUESTRA
Epidermis de la cebolla


PROCEDIMIENTO

1.. En el vidrio de reloj vertemos unas gotas de azul de metileno, y en el vaso de precipitado agua destilada
2.. Despegamos manualmente una capa fina de la epidermis de la cebolla.
3.. Con las pinzas cogemos la epidermis de la cebolla y la dejamos unos minutos en el vidrio de reloj con el azul de metileno para que tiña bien
4.. Pasados los minutos, cogemos la muestra con ayuda de las pinzas y la metemos en el vaso de precipitado con el agua para retirar todo el sobrante de azul de metileno.
5.. Colocamos la muestra en el portaobjetos procurando que no queden pliegues, y con el cubreobjetos cubrimos la muestra sin que nos queden burbujas de aire
6.. Secamos el agua sobrante con un trozo de papel absorbente con mucho cuidado de no romper el cubreobjetos.
7.. Colocamos el portaobjetos en la platina del microscopio y subimos la platina regulando los anillos macrométrico y micrométrico hasta ver las células de nuestra muestra. El objetivo que debemos utilizar es el de 10x.


LECTURA DE RESULTADOS

Con esta practica podemos ver las celulas vegetales de la cebolla, y su forma hexaédrica alargada característica

En las células observadas se diferencia la membrana, el citoplasma y el núcleo en las zonas que están mas teñidas de azul.

Introducción al manejo del microscopio

MATERIAL

• Microscopio 
• Portaobjetos
• Hoja de papel cuadriculado
• Bolígrafo 
• Cinta adhesiva (transparente)

PROCEDIMIENTO
1.. Recortamos un trozo de papel cuadriculado de igual tamaño que el portaobjetos.
2.. dibujar en medio del trozo de papel recortado un signo ''+'' con dos trazos de cuatro cuadros cada uno.
3.. Escribimos lo mas pequeño posible:
        Una letra D en el extremo derecho del sigo +
        Las letras IZ en el extremo izquierdo
        Las letras SP en el extremo superior
        Las letras IN en el extremo inferior
4... Fijamos el trozo de papel al portaobjetos con la cinta adhesiva.
5.. Colocamos el portaobjetos con la parte donde hemos puesto el trozo de papel hacia arriba.
6.. Enfocamos el centro del signo + con cada uno de los objetivos (de menor a mayor aumento) menos con el de inmersion.
7.. Con el objetivo de menor aumento enfocado en el centro del signo + nos desplazamos hacia cada extremo del signo, utilizando los tornillos reguladores de la platina, hasta ver las letras que hemos escrito anteriormente.

LECTURA DE LA PRACTICA
Se puede sacar como conclusión que las letras que visualizamos las vemos de forma invertida.

Medicion con bureta

MATERIAL

• Soporte universal
• Nuez
• Pinza para soporte universal
• Bureta
• Papel de filtro
• Vaso de precipitado
• Embudo
• Agua destilada

REALIZACIÓN

1.. Montamos correctamente el soporte universal.

2.. Una vez montado el soporte universal, colocamos la bureta asegurandonos de que quede bien sujeta

3.. En la parte superior colocamos el embudo y llenamos de agua destilada

4.. Retiramos el embudo de la bureta y colocamos el vaso de precipitado debajo de la bureta. 

5.. Enrasamos hasta cero con ayuda de la llave de la bureta. 

6.. Vaciamos en otro vaso de precipitado hasta la medida que nos indique el profesor o a la medida deseada.

Medición con pipeta

MATERIAL

• papel de filtro 
• vaso de precipitado
• vaso de precipitado con agua destilada.
• prepipeta
• pipeta graduada o aforada

REALIZACION

Imaginemos que queremos hacer una medicion de 2,5ml en una pipeta de 5ml

1.. Colocamos el papel de filtro para evitar ensuciar la mesa de trabajo en la que vamos a realizar la medicion

2.. Introducimos la pipeta en el vaso de precipitado que contiene el agua destilada, y con la ayuda de la micropipeta enrasamos a cero.

3.. Vaciamos hasta enrasar en la cantidad que deseamos medir, en este caso nuestra linea de enrase debera estar en 2,5ml

4,, Vertemos todo lo que nos queda de agua destilada en el interior de la pipeta, los 2,5ml.

De esta manera ya hemos realizado una medicion de 2,5ml de liquido o disolucion

• En el caso de que nuestra pipeta graduada no tenga el cero en el extremo superior de la escala, llenaremos con agua hasta el numero que queramos medir, en este caso seria 2,5ml, por lo que el volumen del liquido se nos quedara por la mitad de la pipeta
• Si tenemos una pipeta aforada o de doble aforo, tendremos que coger una que lleve medido exactamente el volumen que queremos medir. Enrasaremos hasta la linea de aforo y vaciaremos hasta la siguiente linea en el caso de ser de doble aforo, y si es con una sola linea de aforo vaciaremos hasta el final de la pipeta.