Con esta práctica vamos a separar
las moléculas de la hemoglobina mediante la electroforesis
MATERIAL
- Gradilla
- tubos de centrífuga
- pipeta pasteur y graduadas,
- centrífuga,
- material para electroforesis
- rodillo y placa de vidrio
- agitador
- REACTIVOS: suero fisiológico, agua destilada, solución decolorante
(ácido acético 5%), solución transparentadora (metanol+ciclohezanona+ácido
acético glacial), cloroformo, metanol, tampón pH 8'8, colorante (negro amido).
MUESTRA
Preparado de sangre hemolizada
PROCEDIMIENTO
1..Realizamos el hemolizado de la siguiente manera:
- Ponemos 3 ml de sangre anticoagulada en 2 tubos de centrífuga.
- Centrifugamos a 3500 rpm durante 10 minutos y retiramos el sobrenadante.
- Añadimos 4-5 ml de suero fisiológico, homogeneizamos y volvemos a centrifugar.
- Lavamos 3 veces más (en total realizamos 4 lavados)
- En el último lavado, nos quedamos con el sedimento (aproximadamente 1 ml).
- Al sedimento le añadimos medio volumen de cloroformo y 1'5 volumenes de agua destilada (en nuestro caso al tener 1 ml de sedimento añadimos 0'5 ml de cloroformo y 1'5 ml de agua destilada) y volvemos a homogenizar.
- Volvemos a centrifugar pero a 3500 rpm durante 20 minutos.
- Cogemos el sobrenadante (hemolizado) y lo añadimos en un tubo de ensayo, ya que es la muestra que necesitamos.
2.. Ponemos la solución tampón en la cubeta y colocamos una
tira de cellogel en la cubeta y lo empapamos de tampón durante 10 minutos.
3.. Preparamos la fuente de alimentación, la cubeta y los
electrodos correctamente (el rojo es el ánodo (+) y el negro es el cátodo (-)).
4.. Sacamos la tira de la cubeta, la secamos un poco con papel
de filtro
5.. Colocamos la tira en el puente de manera que la cara
absorbente esté hacia arriba (ponemos la esquina cortada en la derecha y
mirando hacia nosotros).
6.. Sabiendo que el hemolizado irá del cátodo al ánodo,
pondremos una marca lo más cerca del cátodo para indicar dónde colocaremos la
muestra.
7.. Empapamos un capilar con el hemolizado y dónde hemos
colocado la marca añadimos una línea fina de hemolizado.
8. Tapamos la cubeta y ponemos en marcha el alimentador, a 400
voltios durante 15 minutos.
9. En una bandeja, ponemos negro amido, en otras tres ponemos
ácido acético al 5 %, en otra metanol y en otra solución transparentadora.
10.. Pasado el tiempo de la electroforesis, colocamos la tira de
cellogel (boca abajo) en la bandeja de negro amido, durante 10 minutos y
agitando la bandeja (lo colocamos en un agitador).
11. Pasado el tiempo, colocamos la tira en la bandeja de ácido
acético y hacemos 3 lavados de 10 minutos en total (también agitándolo).
12.. Pasado el tiempo, colocamos la tira en metanol durante 1
minuto.
13.. Colocamos la tira en la solución transparentadora entre 2 y
3 minutos.
14.. Sacamos la tira de la
solución transparentadora, la colocamos en una placa de vidrio (cara
absorbente hacia abajo) y la aplastamos con el rodillo.
15. Colocamos la placa de vidrio en la estufa hasta que la tira
quede transparente (5-6 minutos).
LECTURA DE RESULTADOS
No se han podido diferenciar bandas en nuestra práctica.
