Detección de crioglobulinas

FUNDAMENTO

La detección de crioglobulinas se basa en la exposición del suero problema a la acción de una temperatura baja (4ºC)

Si el suero problema contiene crioglobulinas, éstas precipitan con el frío, y el precipitado formado adopta el aspecto de partículas blanquecinas

MATERIAL

• Pipeta Pasteur
• Tubo de ensayo 
• Gradilla
• Baño de agua
• Capilar no heparinizado (azul)
• Plastilina
• Centrífuga hematocrito
• Lector de microhematocrito

MUESTRA

Suero transparente, obtenido de sangre coagulada completamente a temperatura corporal y separado del coágulo en un ambiente cálido.

Es importante evitar que la coagulación se produzca en un ambiente frío, pues esto puede dar lugar a la formación de una pequeña cantidad de crioglobulinas.

PROCEDIMIENTO

1.- Depositamos el suero problema en un tubo de ensayo y centrifugamos a 3500 rpm durante 15 minutos

2.- Colocamos el suero a unos 4ºC y observamos durante 6 dias.

LECTURA DE RESULTADOS
Si aparecen partículas blanquecinas en el suero, lo incubamos a 37ºC. Tras la incubacion, si no desaparecen las particulas , se considera que éstas se deben a restos de fibrina . Cuando estas desaparecen se estima que son crioglobulinas precipitadas (prueba positiva).
   

                                                         El grado de positividad:

                                           ASPECTO SUERO                GRADO POSITIVIDAD

                                           Discretamente turbio ....     +

                                           Francamente turbio .......    ++                

                                           Lechoso  ........................     +++

En el caso en que la prueba sea positiva, puede realizarse una semicuantificación de las crioglobulinas presentes en el suero, mediante la determinación del CRIOCITO.

Para medir el criocito:

  1.- Cogemos de la nevera (4ºC) un tubo capilar hematocrito y llenamos las 3/4 partes de éste con suero problema

  2.- Centrifugamos a 10500 rpm 5 minutos

  3.- Calculamos el % de la columna de precipitado de crioglobulinas y el ocupado por el suero total en forma de porcentaje. 

Estudio de un concentrado de leucocitos

FUNDAMENTO

Cuando centrifugamos la sangre anticoagulada obtenemos tres capas: la inferior con leucocitos, la intermedia con leucocitos y plaquetas (buffy coat), y la capa superior que contiene el plasma.



MATERIAL

• tubo centrífuga
• pipeta Pasteur o automática
• 2 portaobjetos
• Reactivos: panóptico rápido (podemos usar la tinción que queramos) 

MUESTRA
sangre venosa anticoagulada

PROCEDIMIENTO
1.- ,Centrifugar la sangre a 1500 rpm durante 30 minutos
2.- Retiramos el plasma
3.- Cogemos de 0.2 a 0.3 ml de la placa leucoplaquetaria
4.- Realizamos un frotis con unas gotas de la placa leucoplaquetaria
5.- Teñimos con panóptico rápido y miramos al microscopio.

Al observar por el microscopio el frotis con la capa leucoplaquetaria podemos observar numerosos leucocitos de todos los tipos, ademas de facilitarnos la visualización de numerosas plaquetas.

En la práctica realizada en clase no se han observado leucocitos con alteraciones.

Fórmula leucocitaria

FUNDAMENTO

Con esta práctica vamos a calcular el porcentaje de leucocitos de cada tipo con respecto al total de ellos.

MATERIAL

• Microscopio 
• Registrador automático de células
• Portas
• Duquesitas con los colorantes para el panóptico rápido
• Vaso de precipitado
• Reactivos: colorante nº1, nº2, nº3. y agua destilada

MUESTRA 

Un frotis teñido con un colorante que hayamos usado en clase. En este caso, he ultilizado el panóptico rápido, ya que nos permite teñir varias estructuras célulares.

PROCEDIMIENTO

1.. En el microscopio, con el objetivo de 10x buscamos una zona donde los hematíes no estén superpuestos y los leucocitos se encuentren en una buena proporción.

2.. Enfocamos la zona con el objetivo de 100x y describimos el resultado haciendo un recorrido en forma de almenas.

LECTURA DE RESULTADOS.

A lo largo del recorrido, debemos contar los leucocitos de cada tipo que encontramos.

Con el registrador automático de células podemos saber el porcentaje de cada leucocito.

Debemos presionar el botón correspondiente a cada leucocito cada vez que encontremos uno. En total tenemos que contar 100 leucocitos.

Contaje de reticulocitos.

INTRODUCCIÓN.

Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen retículos e su interior con restos de ADN, mitocondrias y otros orgánulos celulares.
Su cantidad en sangre dependen de la actividad eritropoyética.

METÓDICA

FUNDAMENTO 
Con colorantes vitales como el azul de metileno o azul de cresil brillante podemos ver los reticulocitos al microscopio. Estos colorantes hacen que los restos de ADN precipiten y se observen como unos filamentos de color azul intenso en el interior de la célula.
Según el grado de maduración de los reticulocitos podremos ver redes de reticulocitos más o menos densas, correspondiendo la red más densa a los retículos más jóvenes.

MATERIAL

• Microscopio
• Tubos de hemólisis
• Pipetas Pasteur
• Portas
• Baño de agua
• Reactivos: Azul de cresil brillante y aceite de inmersión.

MUESTRA

Sangre venosa

 

PROCEDIMIENTO
1.. En un tubo de ensayo introducimos tres gotas de colorante azul de cresil brillante y tres gotas de sangre.

2.. Tapamos con parafilm e introducimos al baño unos 5 minutos a una temperatura de 37ºC.

3.. Sacamos el tubo de ensayo del baño y homogeneizamos suavemente

4.. Con una pipeta Pasteur cogemos unas gotas y hacemos un frotis,

5.. Observamos la muestra al microscopio con el objetivo de 100x.

LECTURA DE RESULTADOS
Al observar por el microscopio veremos los hematíes de un color verde amarillento y los reticulocitos presentaran unos hilos finos de color azul oscuro en su interior.
Para calcular el porcentaje de reticulocitos en la sangre contamos los reticulocitos y lo dividimos entre el número de hematíes contados.
Los valores normales estan entre 0'5%  y 1'5%
Habrá reticulocitosis en anemias hemolíticas y post-hemorragias, ya que aumenta la producción de hematíes para contrarrestar la pérdida de éstos.
Decimos que hay reticulopenia en anemias que dificultan la eritropoyesis.

En clase no hemos podido observar la muestra.

Tinción supravital con azul de metileno

FUNDAMENTO.

En esta práctica vamos a utilizar el colorante básico azul de metileno para teñir los núcleos.

MATERIAL.

• microscopio
• portas y cubres
• tubo de hemólisis
• pipetas Pasteur
• papel parafilm
• Reactivos: Azul de metileno al 0'5%.

MUESTRA

Sangre venosa anticoagulada.

PROCEDIMIENTO

1.. En un tubo de ensayo introducimos dos gotas de sangre y dos gotas de azul de metileno con la pipeta Pasteur.

2.. Tapamos con parafilm el tubo de ensayo y dejamos reposar 10 minutos.

3.. Pasados esos 10 minutos cogemos con una Pasteur dos gotas de la solución y las ponemos en un porta.

4.. Colocamos el cubre encima de la gota, de tal forma que la muestra va a cubrir toda la superficie del cubreobjetos.

5.. Observamos al microscópio con el objetivo de 40x.

LECTURA DE LOS RESULTADOS.

Podemos ver los nucleos celulares teñidos y los eritrocitos toman un color azulado en sus bordes.

Detección de cuerpos de Heinz

METÓDICA

FUNDAMENTO
Los precipitados intraeritrocitarios de Hb desnaturalizada se tiñen con el cristal violeta y adquieren el aspecto de pequeñas granulaciones que reciben el nombre de cuerpos de Heinz.

MATERIAL

• Tubo de ensayo
• 2 pipetas graduadas o pipetas pasteur graduadas
• Una pipeta pasteur
• Un baño de agua
• 2 portas para realizar la extensión
• Microscopio
• Reactivos: Colorante = solución de cristal violeta.                                                                                                               aceite de inmersión

MUESTRA
Sangre venosa

PROCEDIMIENTO
1.. Mezclamos volúmenes iguales de la solución de cristal violeta y de sangre. En la práctica de clase hemos mezclado 1ml.2.. Metemos en el baño de agua la muestra durante 5 minutos a 37º3.. Agitamos manualmente para terminar de homogeneizar con movimientos circulares suaves4.. Hacemos una extensión con la mezcla y la dejamos secar5.. Observamos al microscopio con el objetivo y aceite de inmersión.

LECTURA DE LOS RESULTADOS.
Los cuerpos de Heinz una vez teñidos , se observan como pequeñas granulaciones de color púrpura que se localizan en la periferia de los hematíes.

En clase no se ha podido ver bien la muestra, ya que el colorante estaba mal filtrado.

Determinación del valor hematocrito mediante el micrométodo.

INTRODUCCIÓN

Cuando se centrifuga la sangre, la fracción forme que contiene los hematíes se agrupa en el fondo del tubo y el el plasma se queda en forma de sobrenadante.
El valor de hematocrito es la relación existente entre el volumen ocupado por los hematíes y el ocupado por la sangre total, expresada en forma de porcentaje.
Este valor varia según la zona vascular del organismo. El hematocrito de la sangre capilar es algo superior al de sangre venosa.

METÓDICA

FUNDAMENTO
El valor hematocrito puede determinarse por métodos manuales o por métodos automáticos. El metodo manual es el que realizaremos en clase. Se basa en la centrifugación de la sangre.
Con el método manual tambien se cuenta el volumen de los hematíes, el de los leucocitos, el de las plaquetas y el del plasma que queda atrapado entre los hematíes. Por ello el método automático es más exacto.

MATERIAL
Tubos capilares heparinizados (sangre capilar)
Plastilina
Algodón o gasas
Lanceta
Centrifugadora de microhematocrito.
Regla milimetrada o lector de hematocrito.
Reactivos: alcohol para desinfectar.

MUESTRA
Se puede utilizar sangre venosa o sangre capilar. Utilizaremos la sangre capilar.

PROCEDIMIENTO
1.. La determinación ha de hacerse por duplicado
2.. Llenar la 3/4 partes de los capilares con sangre capilar 
3.. Sellar el extremo por donde ha entrado la sangre con plastilina. Para ello haremos pasar el capilar por la plastilina.
4.. Colocar debidamente equilibrados los capilares en la centrifugadora. El extremo tapado debe quedar hacia fuera.
5..Centrifugamos durante 5 minutos. Si el plasma sale enturbiado aumentaremos el tiempo a unos 6 minutos.

LECTURA DE LOS RESULTADOS
Puede realizarse de dos maneras: 
Midiendo las columnas formadas en el interior de los capilares con una regla milimetrica y calculando el porcentaje que le corresponde a la columna de etritrocitos, con una regla de tres.

O mediante un lector de hematocrito. 

Para medir con el lector:

1ºsituamos el capilar en la ranura con el hematocrito hacia el punto rojo.

2ºgirar el disco central hasta hacer coincidir:

  -la linea más alejada del punto rojo, con el final de la columna del               plasma

  -la linea más cercana al punto rojo, con el inicio de la columna de                 eritrocitos.

  -la línea central, con la interfase de separación presente entre el plasma y     los eritrocitos.

3º leer en la escala inferior, el valor de hematocrito.

INTERPRETACIÓN CLINICA DE LOS RESULTADOS.
El valor normal de hematocrito está comprendido entre el 42 y 47% en las mujeres, y entre el 45 y el 52% en los hombres.
Un valor bajo suele indicar el padecimiento de una anemia. 
Un valor alto de hematocrito suele ser signo del padecimientode una poliglubina